HTRF®について

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HTRF®の特長

今、お困りではありませんか?

  • EIA/ELISAで検討したいサンプル数が多過ぎて、手間がかかり過ぎる。もっと簡単に早くデータを取る方法はないだろうか?
  • イムノアッセイで使う抗体の特異性は高いけれど抗原との結合強度が弱くて洗浄のステップで結合が外れてしまう。洗浄ステップなしで測定できる方法はないだろうか?
  • 様々に条件を組み合わせてデータを取りたいが、レアサンプルなので条件を振るだけの量が・・・。
  • 蛍光測定をしているけど、細胞の自家蛍光の干渉できれいなデータが取りにくい。
  • 低分子物質をHPLCやEIAで定量したいが、酸での除タンパクや中和、蛍光誘導体化などの前処理が面倒だ。もっと簡単な手法はないだろうか?
  • 反応の結果が出るまでに3〜4時間、もしくは一晩を要するのは待ちくたびれる。30分~1時間程度で結果の傾向さえわかれば、次に何を検討すべきか、効率よく準備できるのに・・・。

これらを解決できるHTRF®という手法をご存知ですか?
HTRF®:Homogeneous Time-Resolved FRET( 均一性時間分解蛍光法)

  • 2種の蛍光標識物質を使用するFRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)法を応用したアッセイで、時間分解蛍光測定が可能なプレートリーダーで測定します。
  • ELISA, ELISPOTで必須だった洗浄工程が不要で、アッセイが簡便です。
  • 96 well, 384 wellプレートに対応。384 wellの場合、サンプルは1ウェル当たり2〜10μlで充分なので、貴重なサンプルや高価な試薬、抗体等の使用量を抑えることができます。
  • 長寿命蛍光を測定するため、短寿命蛍光を発する内因性のタンパク、核酸等の共存物質や反応に関与しない酵素、基質などの影響を受けません。これに付随して、除タンパク等のサンプルの前処理の手間も省けます。
  • 蛍光標識試薬を添加後30分~60分で測定が可能です。さらに、FRETのドナー側、アクセプター側、どちらの蛍光標識物質も測定により減衰がありません。よって繰り返し測定ができます。

HTRF®の測定原理、もう少しご紹介します。

基本原理

蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)

FRETは2つの蛍光分子の間で、一方の蛍光分子(ドナー側)が励起されると、蛍光を発する代わりにもう片方の蛍光分子(アクセプター側)にエネルギーが渡され、アクセプター側の分子から蛍光が発せられる現象です。2つの蛍光物質間の距離が近いとFRETの効率は高くなります。(図1、図2参照)

安定した蛍光物質

ドナー側に長寿命蛍光を発するクリプテートEu3+を採用

FRET法を応用して特定の組み合わせの分子間で結合が生じたかを検出するために、弊社はHTRF®法のドナー側に長寿命蛍光を発するクリプテートEu3+を採用しています。クリプテートEu3+とは、希土類元素のユーロピウムイオン(Eu3+)を特殊な籠状構造の配位子の中央部に配座した蛍光物質(図3参照)で、励起光の照射により励起状態になる時間が一般的な蛍光物質の蛍光寿命の約100,000倍にあたる数百マイクロセカンド持続します。同様の籠状構造を有するクリプテートTb3+も取り揃えています。

アクセプター側にはアロフィコシアニン(APC)の誘導体であるXL665(105 kDa)に加えd2(1,000 Da)を採用しています。

 

安定性の高い蛍光物質

ドナーのクリプテート及びアクセプターのd2は安定性に優れた有機化合物です。普通の生物系アッセイであれば安定性に心配することなく実験することができます。クリプテートはキレートではなく環境構造なので安定しておりPCRにも利用することも可能です。アクセプターのXL665は安定性向上を目的に化学的修飾を行っておりますが、タンパク質ですので下記条件内での実験をお勧めします。

XL665を用いた場合の実験条件範囲
pH pH 5~9
有機溶媒 20% (v/v) 以下
界面活性剤 2.0% (v/v) 以下
SDS 0.05% 以下
温度 40℃ 以下

 

安定したアッセイ

■実験の際に遮光は不要です(照明直下で実験可能)。

■繰り返しの測定が可能です。

■相互作用の経時的キネティックス反応データが取れます。

■実験室の温度変化による影響を受けにくい。

■二価イオン(Mg2+、Mn2+など)の影響を受けにくい。

■バッファーのしゅるいによるドナー、アクセプターへの影響はありません。

 

TR-FRET法

時間分解蛍光法(Time-Resolved FRET)

励起光の照射によりドナー側のクリプテートEu3+からアクセプター側に蛍光共鳴エネルギー転移が生じると、アクセプター側の蛍光物質も数ミリセカンドの長寿命蛍光を発することになります。したがって、励起光照射後、FRETに関与しないbackgroundが発する蛍光が消滅した後に測定ポイントをずらすことで短寿命蛍光を発する共存物質の影響を排除し、FRETの結果生じた蛍光のみを検出することが可能になります。(図4 参照)

リアルタイム補正

擬陽性の極めて少ないイムノアッセイ(化合物スクリーニング)

上記TR-FRETの原理から、HTRFⓇ法は洗浄工程がなくても安定な蛍光シグナルを測定できる手法であり、false-positive ヒットを極力除外したい化合物評価系にも応用されています。また、ドナー(620nm)とアクセプター(665nm)の蛍光強度比(Ratio)を取ることで着色物質の影響を排除できます。このように、HTRF®法の最大の特長は、目的外の分子からの複雑な影響を意識することなく、標的分子間の相互作用を簡単に測定できる点にあります。

簡単なプロトコル

混ぜて測るだけ(mix&measure)

HTRF® は洗浄工程が不要で、極めて簡単なプロトコルで測定が可能です。

TNF-α, Humanキットのプロトコル

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

TNF-α, Humanキットのプロトコルのダウンロードはこちらから

 

試薬の少量化(ミニチュア化)

HTRF®はアッセイ容量を変えることで簡単にミニチュア化が可能です。測定する蛍光強度は試薬濃度に依存する為、ミニチュア化する際は次の点について注意が必要です。

■ 各試薬は添付文書に記載される適正濃度で使用し、希釈して使用しない。
■ ミニチュア化する際は各試薬の濃度及び比率を変えず、アッセイ全体の容量を減らす <図5>。
■ プレートを変えずにアッセイ容量のみを減らすと、測定器の焦点が液面直下に当たらず十分なシグナルを得ることができない <図6>。
■ アッセイ容量に適したマイクロプレートを使用する。

各プレートでの推奨アッセイ容量

プレートの種類 推奨アッセイ容量
96穴        200μl
96穴ハーフエリア     80 – 100μl
384穴         80μl
384穴スモールボリューム         20μl
96穴ローボリューム (Cisbio製)         20μl
1536穴           8μl

 

豊富な応用例

HTRF®法を用いてこのような反応の測定が可能

HTRF®法はこれまで世界中の大手製薬企業、バイオテック、国公立研究機関や大学においてイムノアッセイはもちろん、キナーゼ、プロテアーゼ等の酵素活性測定や、タンパク質ータンパク質、受容体バインディング、DNA・RNAの分子間相互作用の解析など幅広く応用されてきました。弊社のラインナップで測定可能な反応のいくつかを測定原理と共に以下にご紹介します。

上記の他にも
バイオマーカーサイトカイン定量キット
◆ セルベースのCa2+アッセイを代替するIP-One測定キット
エピジェネティクス関連(酵素活性、阻害剤探索)
抗体医薬・バイオプロセス関連
◆ 任意の生体分子や細胞、低分子化合物を標識して独自にアッセイを構築できるToolbox試薬
total,150種類を超える豊富な製品ラインナップをご用意

ユーザー様発表例

HTRF® Symposium in Tokyoにて

発表者: 第一三共RDノバーレ株式会社
創薬基盤ユニット 生物評価研究部
HTSグループ専門研究員
桜井 東洋

【講演タイトル】
Ultra-HTS Using 3456-Well Plate and HTRF Technology in GPCR Drug Discovery

 

Webinarにて

【講演タイトル】 Ligand bias at the angiotensin II type 1 receptor
【発表者】          Trevena

 

Society of Biomolecualr Screening Conference (現 SLAS)にて

 

【ポスタータイトル】  A HOMOGENEOUS CASPASE 3 ACTIVITY ASSAY USING HTRF® TECHNOLOGY
【発表者】                塩野義製薬株式会社(Cisbio合同発表)

【ポスタータイトル】  IP-one, a HTRF homogeneous assay to monitor functional activation of Gq coupled receptors in a HTS format
【発表者】                 Novartis (Switzerland)


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